Drożdże stosowane w piwowarstwie wykazują specyficzny zestaw cech, które wpływają istotnie na charakter i  style piwa. Cechy te wynikają z wielowiekowych procesów „udomowienia”. W tym czasie charakterystyczne właściwości drożdży stopniowo wykształcały się dzięki połączeniu selekcji naturalnej i  selekcji wymuszonej. Efektem takich ewolucji są piwa klarowne, o charakterystycznych nutach smakowych. Współczesny rynek piwa to zdecydowanie rynek konsumenta, charakteryzujący się popytem na nowe rodzaje piw, a piwowarzy coraz częściej poszukują sposobów na uzyskanie produktów oryginalnych, dotąd nieznanych na rynku. Ponieważ to drożdże
mają znaczący wpływ na charakter piwa, selekcja lub doskonalenie ich szczepów może potencjalnie wprowadzić do piwa zarówno cechę oryginalności, jak i funkcjonalności. Doskonalenie szczepów można uzyskać poprzez ukierunkowaną inżynierię genetyczną, a  jednymi z pierwszych genetycznie zmodyfikowanych, dopuszczonych do zastosowania w przemyśle spożywczym już ponad 30 lat temu, były drożdże piwowarskie z genem STA1 kodującym glukoamylazę. Liczne badania naukowe wykazały skuteczność metody inżynierii genetycznej dla poprawy wydajności i jakości produkowanych piw, ale ciągle utrzymuje się niski poziom społecznej akceptacji dla zastosowania organizmów modyfikowanych genetycznie w produkcji żywności. Browarnictwo musi więc stosować bardziej „naturalne” metody dla doskonalenia szczepów przemysłowych.

Eksperymentowanie z drożdżami dzikimi

Dowodem tego, jak zmienia się branża, jest gotowość piwowarów do eksperymentowania z gatunkami drożdży „dzikich” jako szczepami fermentacyjnymi tworzącymi oryginalne profile aromatyczne. Przykładem godnym uwagi jest przemysłowe zastosowanie gatunku Saccharomyces eubayanus. Prawdopodobnie ten gatunek, po raz pierwszy wyizolowany w Patagonii w pierwszej dekadzie naszego wieku, jest zaginionym „prarodzicem” drożdży Saccharomyces pastorianus (Saccharomyces cerevisiae × S. eubayanus). Te ciekawe, międzynarodowe badania naukowezainspirowały dalsze poszukiwania badawcze, które ujawniły szereg istotnych preadaptacji u tego gatunku, przede wszystkim wykształcenie cechy wykorzystania głównego sacharydu browarniczego – maltozy, tworzenie przyjemnych profili zapachowych, zdolność do fermentacji w  niskich temperaturach, a  także wiele mniej pożądanych cech, które można jednak wyeliminować. Obecnie znanych jest osiem dzikich gatunków z rodzaju Saccharomyces, lecz za wcześnie na ocenę, które z nich mogą być stosowane w browarnictwie. Wstępne badania pokazują, że zdolność do wykorzystania maltozy różni się w zależności od gatunku, a charakterystyczny korzenny/dymny fenolowy posmak 4-winylogwajakolu jest wytwarzany przez wszystkie dzikie gatunki Saccharomyces. Ostatnie badania wskazują na możliwość ponownego wykorzystania szczepów S. cerevisiae wykorzystywanych w  innych branżach przemysłu żywnościowego, w celu zwiększenia różnorodności drożdży dostępnych w technologii piwowarskiej. Np. takie drożdże zostały wyizolowane z kultur zakwasów piekarskich. Szczepy wykazują zdolności wykorzystywania maltozy i/lub maltotriozy, najczęściej występujących sacharydów w brzeczce. Inne szczepy, o wysokiej tolerancji na etanol, wyizolowane zostały z rumu cachaça, produkowanego z fermentowanego soku trzcinowego. Również szczep Saccharomyces boulardii, stosowany powszechnie w  preparatach probiotycznych, został uznany za ciekawy w produkcji piw niskoalkoholowych. W  ostatnim czasie źródłem nowych szczepów piwowarskich stały się piwa tradycyjne. Takim przykładem jest grupa drożdży „kveik”, związana z  norweskimi piwami domowymi, które jednak wyraźnie wykazują oznaki „udomowienia”. Drożdże te są zarówno genetycznie, jak i fenotypowo różne od innych drożdży piwowarskich, przypuszczalnie z powodu długiego okresu odizolowania, bez kontaktu z innymi szczepami browarniczymi. Mogło mieć również miejsce nieumyślne wykorzystanie drożdży z alternatywnych środowisk związanych z żywnością i napojami w browarnictwie. Kompleksowe analizy genomów drożdży szczepów piwowarskich zdeponowanych w kolekcjach ujawniły obecność niektórych „szczepów oszustów”, których pochodzenie związane jest np. z przemysłem winiarskim. Również inne niż Saccharomyces sp. – tzw. drożdże niekonwencjonalne – mogą mieć potencjalne zastosowanie w browarnictwie. Dzikie drożdże Lachancea thermotolerans były na przykład wykorzystywane do produkcji piw kwaśnych. Ciekawą cechą tego gatunku jest zdolność do zakwaszania piwa poprzez produkcję kwasu mlekowego, przy jednoczesnej produkcji etanolu. Takie zakwaszenie może być atrakcyjną opcją dla piwowarów zaniepokojonych wprowadzaniem kultur bakterii kwasu mlekowego do swoich technologii. Inne przykłady drożdży o potencjale kwasotwórczym to Lachancea fermentati, Hanseniaspora vineae i Schizosaccharomyces japonicus. Wspólną cechą dzikich drożdży jest ich zróżnicowana zdolność do wykorzystywania sacharydów, przy czym wiele gatunków jest w stanie wykorzystywać tylko glukozę – monosacharyd występujący w zdecydowanie mniejszej ilości w brzeczkach fermentacyjnych. To ograniczenie może być korzystne dla piwowarów, którzy chcą produkować piwa o niskiej zawartości alkoholu. Potencjalnie ciekawe gatunki obejmują także
Cyberlindnera fabianii, Mrakia gelida, Pichia kluyveri, Pichia kudriavzevii, Scheffersomyces shehatae, Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Zygosacchaormyces bailii i Zygosacchaormyces rouxii. Przy wykorzystaniu
takich drożdży o pozytywnych cechach dla warzenia piw niskoalkoholowych lub bioaromatyzowanych, konieczne mogą być dodatkowe procedury w  celu wyeliminowania pewnych braków spowodowanych ich specyficznym „nieudomowionym charakterem”. W niektórych przypadkach może bowiem dojść do nadprodukcji związków aromatu, takich jak octan etylu, może także wystąpić słaba flokulacja komórek, co wymaga dodatkowej filtracji/wirowania piwa. Należy także rozważyć bezpieczeństwo konsumentów. Przykład to drożdże Pichia kudriavzevii o  dużym potencjale do produkcji piwa o  niskiej zawartości alkoholu; równocześnie forma bezpłciowa tych drożdży to Candida krusei, znany czynnik etiologiczny kandydozy u ludzi.

Ewolucja w naturze

W  porównaniu ze szczepami dzikimi, drożdże wyizolowane ze środowisk fermentacyjnych zwykle wykazują cechy zapewniające dominację w tych środowiskach. Szczepy piwowarskie ogólnie uważa się za najbardziej „udomowione”. Oprócz dostatecznej tolerancji na etanol czy stres osmotyczny, są zdolne do wykorzystania maltotriozy, nie tworzą fenolowego posmaku i wykazują silną flokulację. Sekwencjonowanie całego genomu również wykazało, że drożdże wyizolowane z ukierunkowanych procesów fermentacyjnych genetycznie różnią się od szczepów dzikich. Na przykład stosowane szczepy piwowarskie wykazują tendencję do flokulacji, a  także genetyczne znaki udomowienia, w tym utratę funkcji mutacji związanych za  wytwarzanie nieprzyjemnego fenolowego posmaku, zwiększoną liczbę kopii genów związanych z wykorzystaniem i transportem maltozy i maltotriozy oraz powstanie chimerycznego genu kodującego glukoamylazę, umożliwiającą zewnątrzkomórkową hydrolizę maltotriozy. Wydaje się, że fenotypy i  genotypy szczepów piwowarskich pojawiły się naturalnie na przestrzeni wieków, jako kompromis między wymaganiami drożdży dla przetrwania w określonych warunkach, a wymaganiami piwowarów, by wyprodukować ciekawy i smaczny produkt. Biorąc pod uwagę, że odkrycie drożdży jako czynnik sprawczy w procesie fermentacji miało miejsce dopiero w XIX wieku, nie mogła mieć miejsca żadna zamierzona ingerencja ze strony piwowarów. Dzięki rozwojowi mikrobiologii możliwe jest obecnie przyjęcie racjonalnego, ukierunkowanego podejścia do sztucznej ewolucji szczepów drożdży, co pozwala na przyspieszony rozwój szczepów. Strategia ta ma zastosowanie nie tylko dla istniejących szczepów drożdży piwowarskich, ale także do drożdży dzikich, wykazujących interesujące cechy dla browarnictwa, które nie zostały jeszcze udoskonalone poprzez „udomowienie”.

Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna

Podobnie jak ewolucja w naturze, tak i w warunkach laboratorium można dokonać tzw. adaptacyjnej ewolucji drożdży. Zależy ona od różnorodności genetycznej w obrębie populacji oraz przewagi metabolicznej określonego genotypu w selektywnych warunkach środowiskowych. W warunkach laboratoryjnych, środowisko jest definiowane przez eksperymentatora, aby wybrać określony fenotyp. W wielu eksperymentach różnorodność genetyczna opiera się wyłącznie na wskaźniku spontanicznych mutacji. W komórkach drożdży S. cerevisiae częstość mutacji pojedynczych nukleotydów może wynosić nawet 10^-10 na zasadę, w zależności od szczepu, np. jego ploidalności. Częstość ta może zostać zwiększona poprzez użycie mutagenów fizycznych, np. promieniowania UV lub różnych związków chemicznych. Oprócz mutagenezy, mogą mieć zastosowanie metody wprowadzania nowego materiału genetycznego, np. dzięki fuzji protoplastów. Wynik będzie oczywiście zależał od wybranej strategii, ale na pewno określona metoda modyfikacji będzie generowała różnorodność. Oprócz różnorodności genetycznej można selekcjonować szczepy o zwiększonym tempie wzrostu, skróconej fazie adaptacyjnej, zwiększonej żywotności, lepszym wykorzystaniu substratów, prototrofii w przypadku niektórych składników pokarmowych, dobrej flokulacji i sedymentacji. Podczas procesu ewolucji laboratoryjnej stosuje się tzw. "presję selekcyjną", która może być utrzymywana na stałym poziomie przez cały czas lub stopniowo wzrastać, np. jeśli początkowa aktywność szczepu w danych warunkach jest słaba. W niektórych przypadkach, dla selekcji pod kątem konstytutywnych mechanizmów adaptacyjnych i indukowanych, można stosować strategię przerywaną – z naprzemiennymi hodowlami w warunkach selektywnych i nieselektywnych.

Najczęściej używaną metodą dla "uczenia drożdży" jest cykliczne przenoszenie partii szczepów hodowanych w warunkach stacjonarnych w probówkach lub kolbach do hodowli wstrząsanych. Część kultury przenosi się do świeżej pożywki, zwykle podczas wzrostu wykładniczego komórek. To pozwala na selekcję komórek o zwiększonej maksymalnej właściwej szybkości wzrostu lub potencjalnie krótszej fazie zastoju. W przypadku przeniesienia podfrakcji po osiągnięciu przez komórki fazy stacjonarnej, przewagę selekcyjną mogą mieć komórki o zwiększonej przeżywalności po wyczerpaniu składników odżywczych. W trakcie hodowli okresowej wstrząsanej dokonuje się zmiana wielu parametrów hodowli, w tym stężenia składników odżywczych, pH, dostępności tlenu, które mogą wpływać na wynik ewolucji. Alternatywą dla hodowli seryjnych są hodowle ciągłe w kontrolowanych bioreaktorach.

Dobre zaprojektowanie eksperymentów jest kluczem do osiągnięcia sukcesu w adaptacyjnej ewolucji drożdży. Zasada jest tutaj jedna: "otrzymujesz to, co wybierasz". Warto pamiętać, by decydować się na taki wybór warunków środowiskowych, które będą jak najbardziej zbliżone do procesu fermentacji przemysłowej.

Literatura:

    Gibson B., Dahabieh M., Krogerus K., Jouhten P., Magalhães F., Pereira R., Siewers V., Vidgren V. Adaptive Laboratory Evolution of Ale and Lager Yeasts for Improved Brewing Efficiency and Beer Quality. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2020, 11, 23-44. doi: 10.1146/annurev-food-032519-051715.

    Simões J., Coelho E., Magalhães P., Brandão T., Rodrigues P., Teixeira J.A., Domingues L. Exploiting Non-Conventional Yeasts for Low-Alcohol Beer Production. Microorganisms, 2023, 11(2), 316. doi: 10.3390/microorganisms11020316.

    Capece A., Romaniello R., Siesto G., Romano P. Conventional and Non-Conventional Yeasts in Beer Production. Fermentation, 2018, 4, 38. doi: 10.3390/fermentation4020038.

***
Artykuł pierwotnie został ukazany gazecie Kierunek Spożywczy 3/2023