Woda i jej znaczenie technologiczne
    Woda jako produkt reprezentowana jest przez dwie „kategorie towarowe”. Pierwsza z nich to woda pitna, przeznaczona do spożycia przez ludzi i na potrzeby gospodarcze, druga kategoria to wody opakowane (butelkowane). Należą do nich wody lecznicze, naturalne wody mineralne, mineralne wody mieszane, naturalne wody źródlane i wody stołowe.
    Dla przemysłu piwowarskiego woda to podstawowy surowiec i główny składnik piwa. Stanowi ona też jeden z dwu głównych surowców (obok koncentratu lub pulpy) przy produkcji soków owocowych i warzywnych. W przemyśle napojów bezalkoholowych woda to ok. 90% udziału, reszta to cukier i substancje dodatkowe: koncentraty soków owocowych, wyciągi roślinne, słód, aromaty, barwniki, a w napojach gazowanych – dwutlenek węgla. W przemyśle mleczarskim woda odgrywa istotną rolę w procesie regeneracji proszku mlecznego do produkcji mleka i napojów mlecznych fermentowanych, potrzebna jest także przy wytwarzaniu masła, serów twarogowych i kazeiny. W przemyśle mięsnym woda jest ważnym składnikiem wędzonek, kiełbas, wyrobów wędliniarskich, półproduktów mięsnych i konserw.
    Woda technologiczna w całym przemyśle spożywczym musi odpowiadać warunkom wody do picia i celów gospodarczych. Nieco innego uzdatnienia wymaga jedynie woda do mycia opakowań szklanych, która musi być zmiękczona, by nie powodować powstawania osadów i zamglenia na powierzchni butelek.
    Według dyrektywy 98/83/WE i Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 29 marca 2007 roku z późniejszą jego nowelizacją z 2010 r. woda przeznaczona do spożycia przez ludzi nie może zawierać mikroorganizmów chorobotwórczych i pasożytów w liczbie stanowiącej potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego oraz substancji chemicznych w ilościach zagrażających zdrowiu. Do produkcji wody pitnej wykorzystuje się zarówno ujęcia głębinowe, jak i powierzchniowe. Wody podziemne znajdują się pod powierzchnią terenu. Wypełniają pory i szczeliny skał skorupy ziemskiej. Powstają z wód powierzchniowych i opadowych, które na skutek przepuszczalności terenu zlewni wsiąkają do gruntu – do strefy saturacji (ośrodka nasycenia), gdzie gromadzą się w warstwach wodonośnych, tworząc stojące i płynące zbiorniki wód podziemnych. Wody podziemne mają różny skład chemiczny, który zależy od rodzaju i budowy skał, przez które przesiąka woda, stopnia ich zwietrzenia i uziarnienia oraz prędkości ruchu wody. Do wód powierzchniowych zalicza się: wody opadowe, wody strumieni i rzek, wody jezior i stawów oraz wody mórz. Ujęcia takich wód stanowią zwykle obiekty inżynieryjne w postaci np. progów piętrzących. Mogą to być również obiekty zlokalizowane na brzegu rzeki lub jeziora wyposażone w system filtracji na złożu piaskowo-żwirowym. Stopień czystości wód powierzchniowych, ich skład chemiczny i bakteriologiczny jest bardzo zmienny i zależy od geologicznego charakteru zlewni, stopnia i rodzaju jej zagospodarowania, ukształtowania i pokrycia terenu, ilości odprowadzanych ścieków, od natężenia opadów atmosferycznych, a także od pory roku.

Warstwa bakterii formująca się na powierzchni przewodów oraz maszyn, urządzeń rozlewniczych znacznie pogarsza mikrobiologiczną jakość wody oraz może powodować ograniczony przepływ mediów.

    Według rozporządzenia ministra środowiska wody powierzchniowe wykorzystywane do zaopatrzenia ludności w wodę przeznaczoną do spożycia dzieli się na trzy kategorie jakości: A1, A2 i A3. Woda należąca do kategorii A1 wymaga prostego uzdatniania fizycznego, w szczególności filtracji i dezynfekcji, woda kategorii A2 potrzebuje typowego uzdatniania fizycznego i chemicznego, zwłaszcza utleniania wstępnego, koagulacji, flokulacji, dekantacji, filtracji, dezynfekcji (chlorowania końcowego). Woda należąca do kategorii A3 wymaga wysokosprawnego uzdatniania fizycznego i chemicznego, w szczególności utleniania, koagulacji, flokulacji, dekantacji, filtracji, adsorpcji na węglu aktywnym oraz dezynfekcji (ozonowania, chlorowania końcowego).

Heterotroficzna mikroflora wody
    Termin „heterotrofy” obejmuje organizmy wykorzystujące do wzrostu materię organiczną. Bakterie heterotroficzne występują w wodach powierzchniowych, wodzie do picia, żywności, glebie, na roślinach i w powietrzu. Wśród bakterii heterotroficznych przeważają pałeczki gram-ujemne, reprezentujące takie rodzaje, jak: Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Vibrio i Aeromonas, a także gram-dodatnie ziarniaki z rodzaju Micrococcus, krętki oraz bakterie spiralne z rodzaju Spirillum, Spirochaeta. W osadach dennych rozwijają się zazwyczaj beztlenowe bakterie gnilne, beztlenowe bakterie celulolityczne oraz liczne beztlenowe chemoorganotrofy (np. bakterie z rodzaju Desulfovibrio, bakterie metanogenne). Natomiast na podwodnych cząstkach stałych występują liczne bakterie styliksowe (np. Caulobacter), bakterie pochewkowate i nitkowate. (tabela 1).

Fot. 1. Wzrost kolonii bakterii na podłożu agarowym (HPC)

Oznaczenie bakterii heterotroficznych
    Bakterie heterotroficzne w wodzie oznacza się wg normy PN-ISO 6222 metodą posiewu wgłębnego (fot. 1).
    Oznaczenie bakterii heterotroficznych HPC metodą płytkową (ang. heterotrophic plate count) napotyka na szereg ograniczeń. Istotny wpływ na rodzaj i liczbę wykrywanych bakterii będą miały m.in.: skład i natlenienie pożywki hodowlanej, czas i temperatura inkubacji oraz objętość posiewanej próby. Co więcej, nie jest możliwe dokładne ustalenie, jaki procent subpopulacji bakterii heterotrofi cznych jest wykrywanych metodą HPC oraz zróżnicowanie w tej populacji bakterii chorobotwórczych. Od wielu lat stosowano różne metody dla oznaczania liczby bakterii heterotroficznych w wodzie. Przykłady takich metod można znaleźć w publikacji Reasoner’a „Monitoring Heterotrophic Bacteria in Potable Water” [Allen i in., 2004]. Wykorzystując wieloletnie badania mikrobiologiczne w tej dziedzinie można stwierdzić, że:
1) w warunkach laboratoryjnych zastosowanie nawet pożywek nieselektywnych nie daje możliwości symulowania warunków środowiskowych zapewniających wzrost całej populacji bakterii heterotroficznych;
2) nie ma jednego podłoża lub jednej metody pozwalającej na oznaczenie wszystkich bakterii występujących w wodzie;
3) znaczna część populacji, aktywna metabolicznie, występująca w stanie VBNC (ang. viable but not culturable) jest niezdolna do wzrostu w postaci kolonii na pożywkach agarowych [Kręgiel, 2005];
4) wybór pożywki hodowlanej, temperatury i czasu inkubacji powinien zależeć od rodzaju posiewanej próby; pożywki o bogatym składzie odżywczym i wyższej temperaturze inkubacji (35-37^oC) są preferowane dla oznaczenia bakterii z materiału klinicznego, natomiast pożywki uboższe w składniki odżywcze i niższe temperatury (20-28^oC) stosuje się do badania prób środowiskowych, wody, gleby czy powietrza;
5) do oznaczenia bakterii heterotroficznych mogą być stosowane metody wykorzystujące substraty fluorogenne, które umożliwiają prowadzenie szybszych i bardziej dokładnych oznaczeń;
6) istotne zwiększenie liczby HPC odnotowuje się dla dłuższych, trwających nawet 5-12 dni, okresów inkubacji;
7) wszystkie szczepy patogenne lub warunkowo patogenne są bakteriami heterotroficznymi, których część jest zdolna do wzrostu przy zastosowaniu standardowych metod płytkowych, jednakże ich oznaczenie wymaga zastosowania pożywek wybiórczo-różnicujących.

Tab. 2. Występowanie szczepów z rodzaju Aeromonas w środowisku wodnym [WHO, 2004]

    Do oznaczania HPC w wodzie wykorzystuje się głownie trzy metody wysiewów: wysiew wgłębny PP (ang. pour plate), wysiew powierzchniowy SP (ang. spread plate) oraz metodę filtracji membranowej MF (ang. membrane filtration). Wyniki przeprowadzonych badań dowodzą, że występują istotne różnice w oznaczaniu bakterii patogennych w zależności od zastosowanej metody posiewu [APHA 1998; WHO, 2004].

Oportunistyczne bakterie HPC. Aeromonas sp.
    Określenie „bakterie HPC’ oznacza szerokie spektrum rodzajów bakterii, które są saprofityczne (niechorobotwórcze), patogenne (chorobotwórcze, np. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Yersinia enterocolitica powodującym także zakażenia wewnątrzszpitalne. Szczepy) lub oportunistyczne (potencjalnie chorobotwórcze). Szczególne znaczenie przypisuje się jako bakteriom oportunistycznym, wywołującym groźne zakażenia u osób z obniżoną odpornością, te nie są wykrywane jako konkretne rodzaje w rutynowej analizie wody.
    W mikrobiologii wody na szczególną uwagę zasługują pałeczki należące do rodzajów Aeromonas. Bakterie te mogą namnażać się w wodzie, gdyż wykazują niewielkie wymagania pokarmowe, co pozwala im przeżyć, a nawet rozwijać się w najbardziej niesprzyjających warunkach. Rodzaj Aeromonas należy do rodziny Aeromonadaceae i obejmuje obecnie 30 gatunków [Euzeby, 2011], wykazujących wzrost w szerokim zakresie pH (4,5÷9) i temperatury (10÷40^oC). Te gram-ujemne, oksydazo-dodatnie, mezofilne pałeczki występują we wszystkich środowiskach wodnych i uważane są za najistotniejszy czynnik etiologiczny zakażeń ryb w wodach ciepłych (tabela 2).
    Znaczenie kliniczne dla człowieka mają przede wszystkim trzy gatunki: Aeromonas hydrophila, A. caviae i A. veronii. Badania materiału klinicznego pacjentów hospitalizowanych z objawami biegunki potwierdziły występowanie bakterii z rodzaju Aeromonas wykazujących następujące czynniki wirulencji: ciepłochwiejną cytotoksynę, aktywną enterotoksynę, hemoaglutyninę, proteazy oraz elastazy. Na inwazyjność szczepów Aeromonas sp. mają wpływ: wytwarzane przez szczep czynniki wirulencji, wiek i stan zakażonego oraz ilość komórek bakterii. Bakterie Aeromonas sp. były wykrywane w wodach stołowych nawet w ilości 1,9×103 jtk/ml. W systemach wodociągowych w Szwecji bakterie należące do tego rodzaju oznaczano na poziomie 300÷750 jtk/100 ml wody. Omawiane bakterie izolowane były także z systemów klimatyzacyjnych oraz sitek prysznicowych, podobnie jak:Legionella sp. Nasilenie częstości występowania Aeromonas występuje w miesiącach letnich, kiedy temperatura wody przekracza 14,5^oC [Kręgiel i Rygała, 2010]. W Holandii i Polsce liczba bakterii Aeromonas sp. w wodzie pozyskiwanej z ujęcia powierzchniowego przekroczyła wówczas odpowiednio 3×103 i 1,6×102/100ml [Lightfoot, 2003; Kręgiel i Rygała, 2010].
    Mimo licznych wyników prac potwierdzających występowanie różnych czynników wirulencji u szczepów Aeromonas sp. nie doszukano się korelacji między zgodnością cech szczepów oznaczanych w wodzie pitnej oraz szczepów izolowanych z materiału klinicznego hospitalizowanych pacjentów. Wpływ obecności bakterii z rodzaju Aeromonas w wodzie pitnej na zdrowie człowieka nie jest więc do końca wyjaśniony, lecz w niektórych krajach europejskich już proponuje się przyjęcie rodzaju Aeromonas jako dodatkowego wskaźnika mikrobiologicznego dla wody pitnej [Fricker, 2003; Kręgiel i Rygała, 2006a,b].

Według dyrektywy (98/83/WE) woda przeznaczona do spożycia przez ludzi nie może zawierać mikroorganizmów chorobotwórczych i pasożytów w liczbie stanowiącej potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego.

Kolonizacja systemów dystrybucji wody
    Heterotroficzna mikroflora wody wykazuje zdolność kolonizacji wewnętrznych ścianek przewodów instalacyjnych. Wzrost w takich środowiskach następuje w obecności nawet niewielkiego stężenia biodegradowalnych rozpuszczalnych związków węgla (BDOC, ang. „biodegradable dissiolved organic carbon”). Fotodegradacja rozpuszczonej materii organicznej poprzez ekspozycję prób wody na światło słoneczne może dodatkowo stymulować wzrost mikroorganizmów wykorzystujących produkty rozkładu: węglowodany, kwasy tłuszczowe itp. Teoretycznie 0,1 mg węgla organicznego może spowodować wzrost liczby bakterii w 1ml do poziomu 108 jtk. Również fosfor jest czynnikiem stymulującym wzrost drobnoustrojów. Obecność niewielkiej ilości tego pierwiastka (poniżej 50 mg/l) powoduje nawet 10-krotne przyspieszenie rozwoju bakterii [Kręgiel i Rygała, 2006a, 2010]. Heterotroficzna mikroflora dostająca się poprzez system rozlewniczy do wód butelkowanych jest zdolna do wzrostu w temp. 22^oC nawet do poziomu 106 jtk/ml [Fricker, 2003]. Pałeczki Aeromonas sp. wykazują większe zdolności wykorzystywania związków węgla niż inne heterotroficzne bakterie gramujemne obecne w systemach dystrybucji.
    Omawiane bakterie należą do mikroflory najłatwiej adherującej do powierzchni, a więc do prekursorów adhezji i tworzenia biofilmów. Źródłem wtórnego zanieczyszczenia bakteryjnego wody mogą stać się wówczas systemy dystrybucji i linie rozlewnicze. Utworzony biofilm jest bardzo przyjaznym środowiskiem dla rozwoju wielu innych rodzajów bakterii. Warstwa bakterii formująca się na powierzchni przewodów oraz maszyn i urządzeń rozlewniczych, oprócz znacznego pogorszenia mikrobiologicznej jakości wody, może powodować ograniczony przepływ mediów, utrudnioną wymianę ciepła, wzrost tarcia na elementach ruchomych, zapychanie się filtrów i awarie urządzeń. Wzrost bakterii w takich systemach zależy od wielu czynników: rodzaju bakterii, temperatury, składu chemicznego środowiska, rodzaju i stężenia środka dezynfekcyjnego oraz szybkości przepływu wody.
    Komórki bakteryjne żyjące w środowisku biofilmu różnią się fenotypowo od komórek wolnożyjących. Wykazano, że powstanie struktury biofilmu indukuje szereg zmian w ekspresji podstawowych czynników wirulencji. Zmiany te, polegające m.in. na utracie ruchliwości komórek i obniżonej syntezie proteaz, prowadzą do niższej zjadliwości drobnoustroju. Warto nadmienić, że dostępne środki bakteriobójcze wykazują zwykle niższą aktywność w stosunku do komórek tworzących biofilm niż do odmiennych fenotypowo populacji planktonowych. Oporność komórek biofilmu związana jest również z zahamowaniem dyfuzji środka przez warstwę śluzu do docelowych komórek bakteryjnych w strukturze biofilmu [Trafny, 2000].
    Komórki bakterii Aeromonas sp. są stosunkowo małoodporne na typowe chlorowcopochodne środki dezynfekcyjne. Szczepy z gatunków A. hydrophila, A. sobria, A. caviae i A. veronii w badaniach in vitro są bardziej wrażliwe na chlor i monochloroaminę niż bakterie grupy coli i pałeczki Pseudomonas sp. Na podkreślenie zasługuje fakt, że pałeczki Aeromonas sp. w systemach dystrybucji wody wykazują jednak zwiększoną odporność na związki chloru w stężeniach powyżej 0,2 mg/l.  Zjawisko to tłumaczyć należy właśnie tworzeniem biofilmów.
    Właściwie prowadzone procesy uzdatniania i dezynfekcji pozwalają na obniżenie ilości komórek z rodzaju Aeromonas (tabela 3).
    Kluczowymi czynnikami ograniczającymi wzrost bakterii heterotroficznych w systemach dystrybucji wody są: temperatura wody poniżej 14oC, wolny chlor w stężeniu 0,1-0,2 mg/l oraz ograniczenie ilości związków organicznych rozpuszczalnych w wodzie.

Tab. 3. Redukcja ilości bakterii z rodzaju Aeromonas w zależności od zastosowanej metody uzdatniania i dezynfekcji wody [Kręgiel i Rygała, 2006a,b]

* * *

    Bezpieczeństwo zdrowotne wody do picia gwarantuje nie tylko dobór odpowiednich metod wykrywania i identyfikacji bakterii wskaźnikowych, ale także wprowadzenie właściwych kryteriów mikrobiologicznych poszerzających zakres analizy o specyficzne, potencjalnie chorobotwórcze bakterie heterotroficzne. Bakterie oznaczane jako HPC, zwłaszcza należące do Aeromonas sp., jako dodatkowe wskaźniki mikrobiologiczne, mogą stanowić proste i tanie narzędzie kontrolujące czystość sieci wodociągowej, systemów dystrybucji wody, linii rozlewniczych, wpływając na jakość mikrobiologiczną wody do picia oraz przyczyniając się do znacznej poprawy bezpieczeństwa zdrowotnego wody w codziennej konsumpcji i użytkowaniu.

Autor: Dorota Kręgiel, Politechnika Łódzka, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii

Artykuł został opublikowany w magazynie "Agro Przemysł" nr 5/2011

Literatura dostępna na www.agro.e-bmp.pl

Źródło fot.: Universita’ Cattolica del Sacro Cuore, www.sxc.hu