W krajach Unii Europejskiej obowiązują przepisy nazywane pakietem higieny. Obejmuje on rozporządzenia dotyczące zasad higieny środków spożywczych (nr 852/2004 „Higiena środków spożywczych”, nr 853/2004 „Higiena środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego”) oraz zasad postępowania urzędowych kontroli (nr 882/2004 „Kontrola urzędowa żywności”, nr 854/2004 „Kontrola higieny środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego”). Z ww. regulacjami związane jest Rozporządzenie WE 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. „w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych” wraz z nowelizacjami (WE 1441/2007, WE 365/2010 oraz WE 1086/2011). Rozporządzenie WE 2073/2005 wprowadza m.in. pojęcie tzw. kryterium mikrobiologicznego, odnoszącego się zarówno do bezpieczeństwa żywności, jak i do higieny procesu jej wytwarzania (rys. 1). W myśl obowiązujących przepisów producent żywności zobowiązany jest do kontroli nie tylko surowców, dodatków do żywności i produktu końcowego, ale także całego cyklu produkcyjnego.

Badania mikrobiologiczne
    Drobnoustroje bytujące na powierzchni maszyn, rąk i ubrań osób uczestniczących w procesie produkcji stanowią często źródło wtórnych zanieczyszczeń surowców, półproduktów oraz wyrobów gotowych. Stopień zanieczyszczenia powierzchni jest także ważnym wskaźnikiem czystości mikrobiologicznej urządzeń oraz prawidłowości procesów mycia i dezynfekcji. Przedsiębiorstwa sektora spożywczego powinny same decydować o koniecznej częstotliwości pobierania i badania próbek w ramach obowiązujących je procedur opartych na zasadach HACCP. Wyniki badań mikrobiologicznych zależą od zastosowanej metody analitycznej, dlatego też do każdego kryterium mikrobiologicznego powinna być przyporządkowana odpowiednia metoda referencyjna. Rozporządzenie WE 2073/2005 zaleca stosowanie normy horyzontalnej ISO 18593 opisującej, jako metody referencyjne pobierania próbek z powierzchni, metodę płytek kontaktowych i metodę wymazów.

Metoda wymazów
    Stosowana jest do oceny zanieczyszczenia mikroorganizmami płaskich lub wypukłych powierzchni, takich jak: kadzie fermentacyjne, kontenery, beczki, zawory, uszczelki, a także do oceny czystości mikrobiologicznej rąk pracowników. W celu pobrania próby wykonuje się wymaz z badanej powierzchni wymazówką, tamponem z waty, gazy lub gąbki. Do pobierania próbek z powierzchni płaskich lub słabo wygiętych stosuje się szablon w kształcie ramki o znanej powierzchni, zwykle 25 lub 100 cm^₂. Próbki powinny być przechowywane do momentu badania w chłodni o temperaturze 4^oC. Pobraną próbę przenosi się do jałowego płynu do wymazów (zbuforowana woda peptonowa lub płyn fizjologiczny z peptonem) i dokładnie wytrząsa w celu zawieszenia drobnoustrojów w roztworze. W przypadkach, gdy badana powierzchnia została poddana wcześniej procesom mycia i dezynfekcji, zaleca się stosowanie neutralizatorów, które zapobiegają toksycznemu działaniu środków dezynfekcyjnych na mikroorganizmy. Należą do nich m.in.: Tween 80, lecytyna, tiosiarczan sodu, L-histydyna, saponina i inne. Tween 80 oraz lecytyna są przydatne do neutralizowania czwartorzędowych soli amoniowych, tiosiarczan natomiast jest dobrym neutralizatorem dla środków opartych na fluorowcokwasach. Zawiesiny po wymazach powinny zostać poddane badaniom mikrobiologicznym w ciągu 24 godzin od pobrania, poprzez posiewy na płytki z kompleksową/selektywną pożywką agarową/płynną, w zależności od rodzaju oznaczanej mikroflory.
    Jedną z rutynowych procedur w diagnostyce zakażeń bakteryjnych jest pobieranie i bezpieczne transportowanie próbek do laboratorium. Coraz powszechniej znajdują tu zastosowanie gotowe testy do przechowywania lub transportu próbek środowiskowych, zwłaszcza wtedy, kiedy pobieranie próbek odbywa się daleko od laboratorium analizującego próbki. Podłoże transportowe jest wilgotne, zatem drobnoustroje w materiale próbki są chronione przed wysychaniem, a skład medium zapewnia przeżywalność drobnoustrojów podczas transportu do laboratorium. Można do tego celu użyć gotowych podłóż transportowych, np. ESwab BBLTM CultureSwabTM, Hygiene SwabTM, Transwab®.

Metoda wymazów stosowana jest do oceny zanieczyszczenia powierzchni, takich jak kadzie fermentacyjne.

Metoda płytek kontaktowych
    Stosowana jest do oznaczania stopnia mikrobiologicznego zanieczyszczenia gładkich, płaskich powierzchni produkcyjnych, folii opakowaniowych, pergaminów, wieczek, korków i innych drobnych przedmiotów. Płytki kontaktowe lub testy łopatkowe, w zależności od składu pożywki, przeznaczone są do oznaczenia ogólnej liczby bakterii, liczby drożdży i pleśni lub liczby określonej grupy bakterii, np. z grupy coli. W celu inaktywacji ewentualnych czynników dezynfekujących obecnych na badanych powierzchniach, pożywki wzbogacone są w komplet związków neutralizujących.

Metody alternatywne
    W omówionych referencyjnych metodach poboru próbek, ze względu na konieczność inkubacji posianych prób środowiskowych, wyniki analiz uzyskuje się dopiero po kilku dniach, tzn. kiedy badana instalacja lub urządzenie zostały już włączone do procesu technologicznego. W myśl rozporządzenia 2073/2005 przedsiębiorstwa sektora spożywczego powinny mieć możliwość wykorzystywania innych metod analitycznych niż metody referencyjne, szczególnie metod szybkich, o ile ich wykorzystanie daje równoważne wyniki. Do rutynowej kontroli można zatem wprowadzić szybkie metody, pozwalające na monitorowanie stanu higienicznego procesu technologicznego oraz/lub identyfikację organizmów patogennych. Metody alternatywne pozwalają na określenie stopnia zanieczyszczenia powierzchni linii produkcyjnych w prostszy sposób, bez konwencjonalnego wyposażenia laboratoryjnego. Stosuje się je głównie w celu oceny efektywności procesów mycia i dezynfekcji. Są to zarówno metody instrumentalne, jak i proste metody oparte na wizualnym odczycie.

Metoda luminometrii
    Polega na oznaczaniu stężenia ATP (adenozynotrifosforanu). Obecność ATP w próbkach pobranych do oceny stanu czystości w zakładzie wskazuje na istnienie różnych zanieczyszczeń organicznych (pozostałości roślinne, zwierzęce oraz mikroorganizmy). Określenie obecności nie tylko żywych drobnoustrojów, ale także innych substancji organicznych, będących doskonałą pożywką dla mikroorganizmów, stanowi o wyższości metody bioluminescencyjnej nad metodą standardową. W reakcji luminescencji specyficzny substrat - lucyferyna ulega utlenieniu w wyniku reakcji katalizowanej przez oksydazę zwaną lucyferazą. W wyniku oksydacji powstaje utleniona forma lucyferyny - oksylucyferyna, którą charakteryzuje podwyższony stan energetyczny. Stan ten jest jednak nietrwały i oksylucyferyna powraca do niższego stanu energetycznego, emitując energię w postaci światła. Wielkość emisji światła mierzona jest za pomocą luminometru, a wynik podawany jest w postaci umownych jednostek świetlnych RLU (ang. Relative Light Unit).
    Do oceny wyznaczonych punktów pomiarowych metodą luminometrii otrzymane wyniki porównuje się z wartościami progowymi, uprzednio wyznaczonymi dla danej branży, danego zakładu i poszczególnych miejsc pomiarowych. Niski poziom RLU wskazuje, że punkt pomiarowy jest czysty, wolny od zanieczyszczeń organicznych i mikrobiologicznych („pass” - dobrze), natomiast gdy poziom RLU jest wysoki, to punkt należy uznać jako zanieczyszczony substancjami organicznymi („fail” - źle). Dla każdej powierzchni należy ustalić tzw. „tło oznaczenia”, czyli taki poziom RLU, który wynika z rodzaju surowca, rodzaju powierzchni oraz materiału, z jakiego została wykonana. Wartości tła oraz poziom tzw. „pass” (dopuszczalny) ustala się dla czystej powierzchni.
    W Polsce dostępnych jest kilkanaście typów luminometrów o różnym zastosowaniu w zakładach przemysłu spożywczego. Praktyczne zastosowanie w monitoringu higieny mają małe, przenośne luminometry, które umożliwiają wykonanie pomiarów już na obszarze produkcyjnym. Ponadto urządzenia te mają możliwość współpracy z komputerem. Oprogramowanie umożliwia identyfikację i rejestrację próbek oraz opracowanie wyników w arkuszach kalkulacyjnych łącznie z analizą trendu.

Płytki kontaktowe lub testy łopatkowe, w zależności od składu pożywki, przeznaczone są do oznaczenia ogólnej liczby bakterii, liczby drożdży i pleśni.

Testy enzymatyczne
    Pozwalają na wykrycie specyficznych enzymów, a tym samym na detekcję określonych grup drobnoustrojów. Przykładem takiego testu może być MycoMetertest™ dla wykrywania specyficznego enzymu obecnego we wszystkich żywych komórkach grzybów strzępkowych. Jak wykazano, aktywności enzymu korelują z ilością biomasy grzybów. Klasyczne metody kontroli, oparte na metodzie płytkowej, pozwalają na wykrycie zanieczyszczeń pochodzenia pleśniowego dopiero po kilku dniach inkubacji, test enzymatyczny zaś – już po kilkunastu minutach. Inny przykład mogą stanowić tutaj testy Redycult Coliform 100 lub Colilert 18 do wykrywania bakterii grupy coli w wodzie lub innych płynach, w stosunkowo krótkim czasie ok. 18 godzin, oparte na detekcji dwóch specyficznych enzymów: β- galaktozydazy oraz β- glukuronidazy.
    W monitoringu higieny stosuje się również inne proste metody biochemiczne do wykrywania zanieczyszczeń pochodzenia drobnoustrojowego lub pozadrobnoustrojowego, oparte na oznaczaniu: NAD(P), białek lub sacharydów. Ze względu na prostotę wykonania oraz niską cenę testy te są szczególnie przydatne dla małych przedsiębiorstw branży spożywczej oraz placówek gastronomicznych. HY-RiSE® - ten prosty test jakościowy opiera się na oznaczaniu dinukletydu nikotynoadeninowego (NAD, NADH) lub fosforanu dinukletydu nikotynoadeninowego (NADP, NADPH) w reakcji enzymatycznej, której efektem jest powstanie zabarwienia na strefie reakcyjnej paska.
    Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości badanych związków na powierzchni roboczej, nożach, deskach do krojenia, klamkach chłodni, mikrofalówkach oraz rękach pracowników. Dzięki wynikowi otrzymanemu już po 4-5 minutach możemy bardzo szybko ocenić stan zanieczyszczenia powierzchni oraz podjąć natychmiast działania eliminujące nieprawidłowości.

Testy białkowe
    Do wykrywania zarówno białek, jak i aminokwasów mają zastosowanie w branżach, gdzie surowiec/produkt jest bogaty w tego rodzaju związki (przemysł mięsny, drobiarski, rybny, mleczarski). Istnieje kilka różnych testów komercyjnych dla oznaczania substancji białkowych, np. Pro-tectTM, Path-Check Hygiene Protein, Flash™, Clean Card® PRO, Hygicult® On, które umożliwiają wykrycie zanieczyszczeń w czasie 1-10 minut od pobrania próbki, w zależności od poziomu zanieczyszczenia.

Testy sacharydowe
    Służą do wykrywania cukrów prostych lub dwucukrów w czasie około 60 sekund, wskazując na poziom zanieczyszczenia powierzchni. Próbka pobierana jest z powierzchni za pomocą wymazówki, która następnie pod wpływem specjalnych odczynników do reakcji barwnych zmienia zabarwienie, gdy w próbce obecna jest glukoza (test SpotCheck™) lub glukoza i laktoza (SpotCheck Plus™).

* * *

    Wprowadzenie szybkich metod analitycznych do monitorowania stanu higienicznego powierzchni jest uzależnione m.in. od dostępności metody, ceny oraz możliwości zastosowania testu w konkretnych warunkach produkcyjnych. Należy jednak pamiętać, że alternatywne metody analityczne wymagają walidacji w odniesieniu do metod referencyjnych.

Literatura:
[1] Easter, M., (2003). Hygiene monitoring in support of food safety-a review of methods and industry trends. Hygiena International, Society for Food Hygiene Technology, UK, 1-4.
[2] Kręgiel D., (2012). Higiena produkcji pod kontrolą, „Agro Przemysł”, 1, 62- 66.
[6] Kręgiel D., (2011). Zastosowanie luminometrii w badaniach adhezji drobnoustrojów do powierzchni abiotycznych. Laboratoria. Aparatura Badania, 16, 10-14.
[7] Morkis G., (2006). Stopień wdrożenia GHP, GMP i HACCP w przemyśle spożywczym. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 48, 129-145.
[8] Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych. Dz. U. UE L 338/1.
[9] PN-ISO 18593:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalne metody pobierania próbek z powierzchni z użyciem płytek kontaktowych i wymazów.

Autor: Dorota Kręgiel, Politechnika Łódzka

Artykuł został opublikowany w magazynie "Agro Przemysł" nr 2/2012

 Źródło fot.: www.photogenica.pl